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本文轉(zhuǎn)載自“科技日報(bào)”。
定位并切斷DNA上的基因位點(diǎn)，關(guān)閉某個(gè)基因或引入新的基因片段，讓失去希望的病人重獲治愈的可能……CRISPR基因編輯技術(shù)，自問世以來就被譽(yù)為“上帝的手術(shù)刀”。
但是，這個(gè)神奇的“手術(shù)刀”也有失手的時(shí)候，其脫靶效應(yīng)一直是阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵障礙之一。
近日，由來自南京大學(xué)、廈門大學(xué)和南京工業(yè)大學(xué)的科研人員，開發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型載體，可實(shí)現(xiàn)基因編輯可控，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，該成果已在新一期美國《科學(xué)進(jìn)展》雜志上發(fā)表。
來自病毒載體的擔(dān)憂
轉(zhuǎn)基因大豆油、抗蟲棉花、甚至是免疫艾滋病的基因編輯嬰兒……雖然爭論不休，但在短短數(shù)十年時(shí)間里，基因編輯技術(shù)作為一個(gè)新時(shí)代的產(chǎn)物，還是迅速地跟多數(shù)普通人建立起聯(lián)系。但是，說到其中運(yùn)用的工具和原理，很多人就不太熟悉了。
自上世紀(jì)60年代揭示遺傳密碼的秘密之后，人類對基因的改造嘗試就從未停止過。用更形象的說法，基因編輯可以理解為，利用“基因剪刀”將DNA鏈條斷開，對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行改造的過程，無論是增添還是敲除基因，本質(zhì)上都是從分子水平改變生物的性狀。
目前，科學(xué)家們普遍使用的“基因剪刀”是一種名為CRISPR-Cas9的外源DNA，它的誕生離不開細(xì)菌。病毒為了自身繁衍利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌在與病毒抗?fàn)幍倪^程中，在體內(nèi)進(jìn)化出CRISPR系統(tǒng)，能夠不露聲色地將病毒基因從自己的染色體上切除。科學(xué)家們正是利用了這一特性，開發(fā)出了這款的“基因剪刀”。
如何把CRISPR-Cas9送到細(xì)胞中去？這就需要借助到載體的幫助。
根據(jù)基因載體來源，我們可以把基因載體分成5大類，分別是質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、非病毒載體和微環(huán)DNA。其中病毒載體是目前普遍的遞送方式，截至2018年6月，臨床試驗(yàn)中超過70%的基因藥物載體為病毒。將復(fù)合物連接到病毒后，病毒侵入靶細(xì)胞的細(xì)胞核，CRISPR-Cas9這把“基因剪刀”才能發(fā)揮出真正的功能。
逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV），這三大類病毒，已經(jīng)在提供遺傳物質(zhì)的治療方面進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用。然而，構(gòu)建病毒載體是一個(gè)艱苦而且高成本的過程，并且運(yùn)用這些病毒載體遞送并不能做到*。“CRISPR-Cas9的優(yōu)勢很明顯，劣勢也明顯。它存在脫靶效應(yīng)，也可能會切斷目標(biāo)之外的其他區(qū)域，對正常的區(qū)域進(jìn)行切除時(shí)，就會產(chǎn)生很大的損傷。”南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院教授宋玉君說。
研究表明，病毒類載體在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中存在著固有缺點(diǎn)，包括致癌風(fēng)險(xiǎn)，插入大小限制以及會在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒可能造成插入性突變，導(dǎo)致癌癥發(fā)生，向靜脈高劑量注射AAV用于基因治療也會產(chǎn)生嚴(yán)重毒性。
更安全的基因編輯載體來了
病毒作為運(yùn)輸載體用于基因工程的安全性還不能*掌控，因此科學(xué)家們提出了幾種替代的非病毒遞送材料，包括金納米顆粒、黑磷、金屬有機(jī)骨架、氧化石墨烯和各種納米材料。
相比病毒，這些材料在安全性上有了很大的提升。但是，基因編輯的時(shí)間和基因編輯的過程，仍然無法為科學(xué)家所控制。
發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》雜志上的科研成果中，來自南京大學(xué)、廈門大學(xué)和南京工業(yè)大學(xué)的科研人員開發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型非病毒載體，可以通過近紅外光控制“修剪”基因的方式，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)時(shí)間和空間上的基因編輯可控，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
針對CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)，研發(fā)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過長達(dá)一年半的試驗(yàn)，研發(fā)出一種名叫“上轉(zhuǎn)換納米粒子”的非病毒載體，這種納米粒子可以被細(xì)胞大量內(nèi)吞，通過一種光敏化合物將CRISPR-Cas9鎖定在上轉(zhuǎn)換納米粒子上。
宋玉君表示：“紅外光具有強(qiáng)大的組織穿透性，這為在人體深層組織中安全、地應(yīng)用基因編輯技術(shù)提供了可能。”
實(shí)驗(yàn)的觸發(fā)裝置就在于兩種光——近紅外光和紫外光。近紅外光和紫外光具有特殊的性質(zhì)，前者可以穿透人體組織到達(dá)目標(biāo)位置，后者則可以實(shí)現(xiàn)切斷光敏分子。暴露在近紅外光下，這些納米粒子吸收低能近紅外輻射并將其轉(zhuǎn)化為可見的紫外光，能夠自動打開納米粒子和Cas9蛋白之間的“鎖”，使Cas9蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)對靶點(diǎn)基因敲除，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。
該團(tuán)隊(duì)從基因、蛋白及細(xì)胞等多個(gè)角度對該體系的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證，在對荷瘤小鼠進(jìn)行治療的過程中團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，只有近紅外光照射實(shí)驗(yàn)組的腫瘤得到了有效抑制，且從20天后取下的腫瘤大小來看，實(shí)驗(yàn)組腫瘤遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對照組。
該技術(shù)為非病毒載體在基因工程上的運(yùn)用打開了另一扇門。一旦未來這項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)臨床，腫瘤尤其是實(shí)體瘤就能實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)治療，帕金森癥、糖尿病等患者也能從這項(xiàng)技術(shù)中受益。
非病毒載體未來*
病毒載體雖然在臨床中廣泛使用，但其安全不確定性、高昂的制備及運(yùn)輸費(fèi)用制約著其在基因工程中的推廣前進(jìn)。因此，非病毒載體越來越引起研究者的注意。
“目前，各種納米材料的非病毒載體都有科研人員在做，比如可降解的生物高分子材料，它的前景是非常大的。”宋玉君告訴記者。
關(guān)于非病毒載體的研究有兩個(gè)方向，一個(gè)是有機(jī)材料基因遞送體系，另一個(gè)是無極材料基因遞送體系。在有機(jī)材料研究領(lǐng)域中，脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺及其衍生物、陽離子多肽、樹形分子及其衍生物、殼聚糖及其衍生物、聚氨基酯、環(huán)糊精及其衍生物為科學(xué)家研究的主要方向。
各類脂質(zhì)體設(shè)計(jì)的非病毒脂質(zhì)納米粒子易于制備，免疫反應(yīng)不劇烈，而且有更大的有效荷載，因此已經(jīng)在臨床中被廣泛運(yùn)用，如疫苗和基因藥物遞送、癌癥治療、腫瘤影像學(xué)等都會使用這種遞質(zhì)。以聚乙烯亞胺及其衍生物為載體的遞送系統(tǒng)也已經(jīng)運(yùn)用在多重疾病的臨床試驗(yàn)中，包括卵巢癌、胰腺癌、原發(fā)性腹膜惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤等。而其他的遞質(zhì)材料的研究基本沒有進(jìn)入臨床階段。
相比于有機(jī)材料，無機(jī)材料則更容易人為控制，它的尺寸可調(diào)，表面也容易修飾。金納米粒、碳納米管、石墨烯、上轉(zhuǎn)換納米粒等材料均有廣泛研究，主流的遞送方式包括將負(fù)電基因與正電無機(jī)納米粒形成復(fù)合物、將基因以響應(yīng)性共價(jià)鍵形式連接在納米粒上或者在無機(jī)納米粒表面修飾兩親性高分子，負(fù)電荷基因通過靜電作用吸附在高分子層中。宋玉君所在團(tuán)隊(duì)研發(fā)的光操縱基因編輯新技術(shù)還是次。
目前，無機(jī)遞送材料的研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，臨床階段的試驗(yàn)尚未批準(zhǔn)，關(guān)于它對機(jī)體的影響還沒有確切的定論。
“無機(jī)納米粒子含有人體非必須的元素，因此可能會產(chǎn)生一些副作用。我們在實(shí)驗(yàn)時(shí)，對小鼠層面觀察時(shí)間比較短，少至幾周多則幾個(gè)月，在細(xì)胞層面和動物層面還沒有發(fā)現(xiàn)大的影響。如果能夠找到合適、安全、具有相同功能的無機(jī)材料，它的前景將會*。”宋玉君對非病毒載體的未來充滿信心。
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